文章来源
王西西,吴映彤,吴 竞,陈鸿军,郭晓宇,朱鸿飞.非洲猪瘟病毒dp96r蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备. 中国动物传染病学报,2018,26(5):10-15.
摘 要：本研究采用原核表达系统表达非洲猪瘟病毒（african swine fever virus，asfv）georgia 2007/1毒株毒力基因uk，获得重组蛋白(dp96r)，进一步制备并鉴定dp96r重组蛋白的多克隆抗体。elisa结果表明制备的多抗具有良好反应性，western blot和免疫荧光实验(immunofluorescence assay, ifa)表明制备的多抗能特异性识别真核表达的dp96r蛋白。
非洲猪瘟病毒（africanswine fever virus，asfv）是在细胞质内复制的双股大dna病毒，为非洲病毒科、非洲病毒属的唯一成员。asfv georgia 2007/1分离株（asfv-g）属于基因ii型，基因组大小189 344 bp，表达166个开放阅读框。uk(dp96r)基因位于右侧可变区，在不同病毒毒株基因组中序列高度保守，属于病毒毒力基因，是导致家猪发病重要因素之一。
01
uk基因重组质粒的构建
根据asfvgeorgia 2007/1 株 uk基因序列（genbank登录号:fr682468.1）合成uk全基因，并连入puc57-simple载体。以合成的puc57-uk质粒为模板进行uk基因扩增。pcr扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在250～500 bp之间可见单一扩增条带（图1），条带大小与预期相符（uk:291 bp）。将pcr产物进行回收，经双酶切后与载体质粒pet-28a（+）连接并转化dh5hα，挑取菌落进行菌液pcr鉴定后测序验证，测序正确后将重组质粒分别命名为pet-28a-uk、pegfp-n1-uk。
图1 asfv uk基因的pcr扩增
m：dna分子量标准(dl2000)；1:阴性对照；2:asfv uk基因
02
dp96r蛋白的表达形式分析
将原核表达质粒pet-28a-uk转化大肠杆菌bl21（de3）感受态细胞，挑取单菌落接种于卡那抗性的lb液体培养基中，37℃、220 r/min培养od600至0.6~0.8时，加入终浓度为0.4mmol/l iptg，分别在37℃培养5h或在16℃培养10 h后，4℃、12 000×g离心10 min，收集菌体沉淀。沉淀经pbs洗涤后，冰浴条件下进行超声破碎，12 000×g离心10 min后分别取上清和沉淀，进行sds-page分析。sds-page结果表明，iptg浓度为0.4mmol/l时，在16℃诱导10 h或37℃诱导5 h后，pet-28a-uk样品中均出现1条明显的蛋白条带，大小约15 kda，与预测的11kda相差较大，这种差异可能与串联重复序列的存在而导致的异常凝胶迁移率有关，蛋白以可溶性表达为主，空载体pet-28a对照组及未诱导的pet-28a-uk菌液样品中均未出现对应条带（图2）。
图2 dp96r蛋白 sds-page分析
m：蛋白质分子量标准；1：pet-28a空载体对照；2：未诱导的pet-28a-uk菌液；3：16℃诱导10 h后上清；4：16 ℃诱导10 h后沉淀；5：37℃诱导5 h后上清；6：37℃诱导5 h后沉淀
03
dp96r蛋白纯化验证
将重组pet-28a-uk接种至2l卡那抗性lb液体培养基中，37℃、220 r/min培养od600至0.6，加入终浓度为0.4mmol/l iptg，16℃诱导10h后，4℃、12 000×g离心10 min，收集菌体，以pbs洗涤沉淀后再次重悬，冰浴条件下进行超声波破碎至溶液澄清。收集上清液经ni亲和层析预装柱纯化，sds-page和western blot结果表明，纯化后的dp96r蛋白条带较为单一(图3a、3b)。蛋白纯度达到90%以上，bca法定量蛋白浓度为600 μg/ml，满足后期免疫要求。
图3 纯化重组蛋白dp96r的sds-page（a）及western blot（b）鉴定
04
dp96r蛋白多克隆抗体的制备与鉴定
利用纯化的dp96r重组蛋白免疫新西兰大白兔，分别在14、28、38d采血，收集血清并进行间接elisa检测。结果如图4所示，dp96r蛋白首次免疫后2周，抗体水平开始上升，加强免疫后2周抗体水平有显著提高，3次免疫后抗体维持在较高水平，而对照组3次免疫血清抗体检测均为阴性（od450<0.10）。
图4 抗dp96r蛋白多克隆抗体制备与鉴定
05
dp96r蛋白多克隆抗体特异性分析与鉴定
为验证多克隆抗体的特异性，将pegfp-n1-uk质粒和pegfp-n1空载体分别转染293t细胞，进行免疫荧光实验(immunofluorescenceassay, ifa)和western blot分析。ifa结果显示，dp96r蛋白多克隆抗体可特异性识别293t细胞中表达的dp96r蛋白，而与空白对照没有反应（图5）。dp96r蛋白多抗与egfp抗体均可识别蛋白分子量大小约为40 kda的特异性蛋白条带 (图6)。结果表明制备的抗dp96r蛋白的多克隆抗体具较好的反应性和特异性。
图5 dp96r蛋白免疫荧光检测
图6 dp96r 蛋白的western blot检测
a: dp96r 蛋白多抗作为一抗; b: egfp-tag单抗作为一抗；m:蛋白质分子量标准;1:空载体; 2: pegfp-n1-uk
····
非洲猪瘟是世界动物卫生组织（office internationaldes épizooties，oie）法定报告的烈性传染病之一，我国将其列为动物一类传染病，至今仍无有效的商品化疫苗问世，给全球养殖业造成巨大的经济损失。现有asf的防控方法主要是包括流行病学监测、划定疫区以及扑杀受感染动物等。目前，在asf的疫苗研究中，缺失活病毒疫苗是研究重点。本研究针对asfv georgia 2007/1的uk基因，构建了含有his标签的重组原核表达质粒。在原核表达系统中，低温诱导时，dp96r蛋白主要呈可溶性表达，经纯化获得纯度＞90%的重组蛋白。western blot和elisa结果表明dp96r蛋白具有较好的反应原性，制备的多抗可用于western blot检测和ifa检测，为进一步研究蛋白的生物学功能以及建立asfv uk基因缺失毒株鉴别诊断方法奠定了基础。
来源：中国动物传染病学报
原标题：非洲猪瘟病毒dp96r蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
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