[发明公布] 基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用
国家知识产权局官网近日公布中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)申请的发明专利。
发明名称：基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用；
发明人：步志高；陈伟业;赵东明;何希君;刘任强;柳金雄。该发明申请显示，经实验表明所述两种毒株均能提供对非洲猪瘟中国流行强毒株的100％免疫保护，可作为安全和有效的防控中国非洲猪瘟疫情的疫苗，具有极大的社会价值。
发明摘要：本发明涉及可作为疫苗的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒及疫苗以及构建方法。本发明采用非洲猪瘟中国流行株pig/cn/hlj/2018，经基因工程技术，将非洲猪瘟病毒的毒力基因缺失，获得mgf360505r缺失和cd2v与mgf360505r联合缺失的基因缺失病毒。经实验表明所述两种毒株均能提供对非洲猪瘟中国流行强毒株的100％免疫保护，可作为安全和有效的防控中国非洲猪瘟疫情的疫苗，具有极大的社会价值。
发明内容主要包括：
1、针对非洲猪瘟疫苗缺乏和已知疫苗的有效性不够理想，尤其国内疫苗的空白，研发非洲猪瘟基因缺失减毒疫苗的制备方法，并成功获得了两株安全、有效的疫苗株。
2、采用基因工程手段，对中国流行的非洲猪瘟分离株进行毒力基因(cd2v和mgf360-505r)缺失，获得了两株缺失毒株( rasfv△360-egfp和 rasfv△cd2v/360-egfp-mcherry)，经过免疫和攻毒保护效力等系统评价，将效价和安全性均表现优异。
3、提供一种基因缺失减毒非洲猪瘟病毒，其特征在于，将基因i型的非洲猪瘟病毒进行mgf360-505r基因缺失，或进行cd2v与mgf360-505r基因联合缺失而得到的。更优选的是mgf360-505r联合缺失是指mgf360和505r两种基因全部序列缺失，或者cd2v与mgf360-505r联合基因缺失是指cd2v、mgf360、505r三种基因序列全部缺失。
4、所述基因i型的非洲猪瘟病毒是中国流行株pig/cn/hlj/2018，其全长序列已于 genbank公开( genbank:mk333180.1)。
5、优选的mgf360-505r基因缺失病毒相对于原始毒株全长序列缺失了第27942-35500位核苷酸;所述cd2v与mgf360-505r基因联合缺失病毒相对于原始毒株全长序列缺失了第27942-35500位和第73394-74476位核苷酸。更具体构建的mgf360-505r基因缺失病毒，和cd2v与mgf360-505r联合缺失的基因缺失病毒，已于2019年4月11日进行专利程序保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号分别是 cctcc no:v201925和 ctcc no:v201924。
6、还提供了包含本发明的减毒非洲猪瘟病毒的疫苗，本发明的疫苗在受试者中诱导针对随后的非洲猪瘟病毒攻击的保护性免疫应答。
7、疫苗可以包含不同基因型的多种减毒非洲猪瘟病毒。此类疫苗可以能够诱导针对多种asf病毒基因型的交叉保护性免疫应答。
8、还提供了包含一种或多种本发明的减非洲猪瘟病毒的药物组合物。该药物组合物可用于预防或治疗非洲猪瘟。疫苗或药物组合物可以包含一种或多种本发明的减毒非洲猪瘟病毒，进一步任选地包含一种或多种佐剂，赋形剂，载体和稀释剂。佐剂可以任何合适的佐剂，化学类免疫佐剂如氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、司盐等;微生物类免疫佐剂如分枝杆菌、bcc、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质d、短小棒状杆菌;植物类免疫佐剂多为从植物或大真菌中提取的多糖类，如茯苓多糖、红花多糖、中草药类等。而生化类免疫佐剂如胸腺肽、转移因子、白细胞介素等。优选的佐剂可以是纳米佐剂生物佐剂，白介素、干扰素等。
9、本发明的疫苗也可用于联合疫苗，如与猪的其他疫苗联合，但重点在减毒活疫苗上，尤其是病毒基因的整合，如双价苗，三价苗等。联合疫苗可以包含不同基因型的多种减毒非猪瘟病毒，如此可以诱导针对多种非猪瘟病毒基因型的交叉保护性免疫应答。
10、本发明的疫苗的施用可以采用方便的途径，例如肌内注射，鼻内，口服，皮下，透皮和阴道等途径。本发明的减毒疫苗优选采用肌肉注射，合适的剂量为102.5-102.5tcid50，优选剂量为103-103tcid50。疫苗可以在初免-加强方案后施用。例如，在第一次接种后，受试者可以在一段时间(例如约7，14，21或28天)之后接受第二次加强施用。通常，加强施用的剂量相同或低于初免施用的剂量。此外，也可以进行第三次加强免疫，例如免疫后2-3个月、6个月或一年。
11、本发明获得的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒具有下述优势。本发明构建的两株基因缺失非洲猪瘟病毒( rasfv△360-egfp和 rasfv△cd2v/360-egfp- mcherry)在免疫猪后，即使105 tcid50剂量免疫组动物均无体温升高等临床症状，血液和脏器病毒分离均为阴性，存活率均为100％，表明其充分致弱，作为疫苗是非常安全的，且均优于国外基因ii型asfv的类似研究。
国外采用我国流行株同源性极高的 georgia株构建了mgf360-505r基因缺失病毒，在免疫猪后的血液病毒分离阳性率在60％以上;采用基因ii型 malawi li1-20/1株构建的cd2v单基因缺失病毒，在免疫猪后血液病毒分离阳性率为100％、存活率仅为0％。其次，在有效性方面，强毒攻击后，本发明构建的 rasfv△360egfp和 rasfv△cd2v/360-egfp- mcherry免疫保护率均为100％，血液病毒分离阳性率分别小于35％和100％，但在第21-22天均转为阴性，表明两株病毒都具有极佳的免疫保护效力，也明显优于国外采用基因ii型asfv的类似研究。国外mgf360-505r缺失georgial株病毒免疫猪在攻毒后的血液病毒分离阳性率为70％。(其中，本发明采用的103 tcid50免疫剂量小于国外的104had50，但攻毒后血液病毒分离阳性率仅为25％):虽然本发明构建的mgf360-505r和cd2v双基因缺失病毒免疫猪在攻毒后血液病毒分离阳性率为100％，略差于mgf360-505r基因缺失的病毒，但显著优于cd2v单缺失的基因ii型malawi li1-20/1株病毒(免疫后死亡率100％)且攻毒后21天血液病毒分离就转为阴性。最后，本发明构建的两株基因缺失病毒免疫后21天就能够提供充分的强毒攻击保护优于国外的28天。因此，采用流行地区的分离株来构建非洲猪瘟基因缺失减毒疫苗是最佳策略，也是中国研制非洲猪瘟疫苗的关键。因此，本发明构建的基因缺失非洲猪瘟病毒( rasev△360-egfp和rasfv△cd2v/360-egfp- mcherry)具有巨大的应用价值。具体比较见表1.
表1国内外类似基因缺失减毒非洲猪瘟病毒(基因ii型)的安全性比较。
发明专利申请如下：