实验方法原理 细胞凋亡中, 染色体dna 双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-oh 末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（tdt）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到dna 的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,tunel）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有dna 的断裂，因而没有3'-oh形成，很少能够被染色。
tunel 实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
caspase-3 活性的检测
实验方法原理 caspase 家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用， 其中caspase-3 为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。caspase-3 正常以酶原（32kd）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的caspase-3 由两个大亚基（17kd）和两个小亚基（12kd）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3 的活性明显下降。
实验步骤
一、western blot 分析procaspase-3 的活化，以及活化的caspase-3 及对底物多聚（adp-核糖）聚合酶[poly（adp-ribose）polymerase，parp]等的裂解。
方法：收集细胞→pbs 洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→sds-page 电泳→硝酸纤维素膜或pvdf 膜转移→5 %脱脂奶粉封闭，室温1.5~2 h 或4 °c 过夜→caspase-3 多抗或单抗室温反应1~2 h 或4 °c 过夜→tbs-t（含0.05% tween 20的tbs）洗3 次，5~10 min/次→hrp-标记的羊抗鼠igg 或ap 标记的羊抗鼠igg室温反应1~2 h→ tbs-t 洗3 次， 5~10 min/次→ecl 显影或nbt/bcip 显色。
二、荧光分光光度计分析
1. 原理：活化的caspase-3 能够特异切割d1e2v3d4-x 底物，水解d4-x 肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽ac-devd-amc。在共价偶联时，amc不能被激发荧光，短肽被水解后释放出amc，自由的amc 才能被激发发射荧光。根据释放的amc 荧光强度的大小，可以测定caspase-3 的活性，从而反映caspase-3 被活化的程度。
2. 方法：收获细胞正常或凋亡细胞，pbs 洗涤，制备细胞裂解液加ac-devd-amc（caspase-3 四肽荧光底物），37 °c 反应1 h，荧光分光光度计（polarstar）分析荧光强度（激发光波长380 nm，发射光波长为430-460 nm）。
三、流式细胞术分析
方法：收获细胞正常或凋亡细胞，pbs 洗涤，加ac-devd-amc 37 °c 反应1 huv 流式细胞计分析caspase-3 阳性细胞数和平均荧光强度。