Taq酶在聚合酶链式反应细节


1976年chien分离出热稳定聚合酶,1986年erlich分离并纯化了适于聚合酶链式反应的tq热稳定性聚合酶,为聚合酶链式反应成为实用技术奠定了基础,现已用基因重组生产。日前可用于聚合酶链式反应的聚合酶有多种:有从水生栖热菌中提取的taq酶、从嗜热栖热苗中获得的taq酶、从litoralis栖热球菌中分离的vent酶、及从酸热浴硫化裂片苗中分离的sac酶,而以taq酶用得最广泛。taq dna聚合酶分子量为94kd,75℃时酶比活性为150bs/酶分子,反应温度过高或过低均影响其延伸率,taq蕾有很高的耐热稳定性。猪elisa试剂盒实验表明,在92.5℃、95℃、97.5℃时,其半衰期分别为40min、30min和5min。
纯化的taq酶在体外无3'-5'外切酶活性,因而无校正阅读功能,在扩增过程可引起错配。错配碱基的数量受温度、mg2+浓度和循环次数的影响。通常,30次循环taq酶的错配率约为0.25%,高于klenow酶的错配率。taq酶在每一次循环中产生的移码突变率为1/30000,碱基替换率为1/8000。应用低浓度的dntp(各20μmol/l)、1.5mmol/l的mg2+浓度、高于55℃的复性温度,可提高taq酶的忠实性,此时的平均错配率仅为5x10^-6次/(核苷酸*循环)。
taq酶具有类似于末端转移酶的tdt的活性,可在新生成的双链产物的3'端加上—个碱基,尤其是datp最容易加上。因此,欲将聚合酶链式反应产物克隆到载体上,可以用两种处理办法:一是构建dt-载体;二是用klenow酶将3'端的a去掉,即在聚合酶链式反应反应后,先在99℃加热10min灭活taq酶,调整mg2+浓度至5-10mmol/l,加入1-2u klenow片段,室温下作用15-20min,3'端的a即被切去,
以往用taq酶进行聚合酶链式反应扩增,一般只能扩增小于400bp的dna片段,经过对酶的结构与功能的改造,以及聚合酶链式反应方法学的改进,现已能扩增20kb以上的dna分于。
taq酶在聚合酶链式反应反应中加入的量也很重要,太少当然不好,太多一方面浪费,同时也导致非特异性扩增,通常每looμl反应液中含1-2.5u taq酶为好。最在0.5-5u范围内确定佳酶浓度。另一个问题是,虽然taq酶是热稳定性较好的工具酶,也应注意在-20℃贮存。