第一步：了解免疫沉淀是什么？我为什么要做免疫沉淀呢？
免疫沉淀（immunoprecipitation，ip）是利用抗原抗体特异性反应，从特定混合物（通常是细胞裂解液或表达上清）中纯化富集目的蛋白的一种方法。传统的ip实验是抗体与目的蛋白结合后，再与蛋白protein a /g（结合抗体fc片段）偶联的琼脂糖或磁珠孵育，通过离心得到珠子-蛋白a/g-抗体-目的蛋白复合物，复合物经过洗涤、洗脱后用于后续下游实验。ip是许多蛋白质相关研究的重要步骤，用于研究蛋白质的存在、相对丰度、蛋白表达的上下调、蛋白至稳定性及相互作用等。
（传统ip原理图）
总结：
ip的整个过程我需要用到的关键工具有：
一抗：选择能与我的样本发生反应，能做ip实验的一抗；
选择指南:
bmr20500
purkine™ protein a resin
bmr20504
purkine™ protein a resin 4ff
bmr20600
purkine™ protein g resin
bmr20604
purkine™ protein g resin 4ff
bmr20704
purkine™ protein a/g resin 4ff
第二步：发现竟然没有合适的一抗来满足我需要做的免疫沉淀？
某些目的蛋白因为没有对应的特异性抗体而无法进行免疫沉淀，如抗体所识别的抗原表位被相互作用蛋白所遮蔽，无法与目的蛋白相互作用或抗体选择不合适，所选抗体不能识别处于天然构象的蛋白等，可以采用一个表位标记蛋白后，再选择针对此表位的标签抗体来进行免疫沉淀。厂家会推出一些常见的标签抗体用于ip实验，涉及flag、ha、his、myc等标签，以满足大多数客户的需求。
特别是琼脂糖/磁珠偶联的标签抗体，能最大限度优化免疫沉淀实验，节省时间和成本。
1）原理：省去了protein a/g与抗原-抗体复合物结合的步骤，且解决了protein a/g和抗体结合能力弱的问题。偶联抗体直接和目标蛋白结合后，通过离心或使用磁力架，将目标蛋白从细胞裂解液中分离出来。高特异性单克隆标签抗体可实现高产量和高纯度，稳定、预封闭的填料及特异性抗体减少了免疫沉淀过程中的非特异性结合。
（琼脂糖/磁珠偶联的标签抗体应用于ip）
2）选择指南：
a02010agb
anti-ddddk tag mouse monoclonal antibody (1b10), agarose
a02010mgb
anti-ddddk tag mouse monoclonal antibody (1b10), magnetic beads
a02040agb
anti-ha tag mouse monoclonal antibody (4f6), agarose
a02040mgb
anti-ha tag mouse monoclonal antibody (4f6), magnetic beads
a02050agb
anti-his tag mouse monoclonal antibody (5c3), agarose
a02050mgb
anti-his tag mouse monoclonal antibody (5c3), magnetic beads
a02060agb
anti-myc tag mouse monoclonal antibody (2d5), agarose
a02060mgb
anti-myc tag mouse monoclonal antibody (2d5), magnetic beads
第三步：免疫沉淀后wb (ip-wb)出现重链、轻链干扰，怎么办？
在免疫沉淀实验后的wb验证环节中，当使用常规的 anti-igg (h+l) 酶标二抗时，通常会出现对应免疫沉淀一抗变性后产生的重链（50kda）和轻链（25kda）两条带。如果检测的目的蛋白分子量在此附近时，就会受到这两条带的干扰。如何避免干扰，
方法一：选择只和重链或轻链反应的二抗。如果目标蛋白分子量小于30kd，为了避免抗体轻链的干扰，选择重链特异性二抗；如果目标蛋白分子量大于30kd，为了避免抗体重链的干扰，选择轻链特异性二抗；
选择指南：
a25012
ipkine™ hrp, goat anti-mouse igg lcs
轻链特异性
a25022
ipkine™ hrp, mouse anti-rabbit igg lcs
轻链特异性
a25112
ipkine™ hrp, goat anti-mouse igg hcs
重链特异性
a25222
ipkine™ hrp, goat anti-rabbit igg hcs
重链特异性
“使用ipkine mouse anti-rabbit igg lcs 轻链特异性二抗检测nup50蛋白的ip结果，完美解决重链干扰问题！ ” cat #: a25022
方法二：选择wb一抗时，选择和ip用一抗不同的种属，避免ip一抗的干扰；
方法三：选择hrp直接偶联的wb一抗，省去二抗的步骤。
免疫沉淀三步击破，你掌握了吗？如有疑问，欢迎来撩！