t h1 /t h2 细胞因子对心脏移植大鼠npc 输注诱导免疫耐受的作用
李玉侨, 孙立江, 张桂铭, 姚如永
(青岛大学医学院附属医院泌尿外科, 山东 青岛 266003)
[ 摘要] 目的 探讨大鼠血清中 t h1/ t h2 细胞因子表达与供肝非实质细胞(n pc)输注诱导心脏移植免疫耐受的关系。 方法 建立大鼠心脏移植模型, 将 40 只大鼠随机分成排斥反应组、免疫耐受组, 每组 20 只。 观察移植心脏存活时间, 并检测受者血清中 t h1/ t h2 细胞因子白细胞介素 2(il-2)、干扰素γ(if n-γ)、白细胞介素 4(il-4)、白细胞介素 6(il-6)、白细胞介素 10(il-10)的表达水平。 结果 免疫耐受组供心存活时间为(30 .83 ±2 .55)d , 排斥反应组为(8 .15±2 .08)d, 差异有显著性(t =24 .46, p <0 .01)。术后 7 、14 d 排斥反应组血清 t h1 细胞因子 il-2、 ifn-γ水平均高于免疫耐受组, t h2 细胞因子 i l-4、il-10 表达水平均低于免疫耐受组, 术后7 d 血清 i l-6 表达水平显著高于免疫耐受组(t =4 .50 ～ 16 .20, p <0 .01)。 结论 免疫耐受的形成与 t h1/ t h2 细胞因子相互作用有关。
[ 关键词] t h1 细胞;t h2 细胞;心脏移植;肝细胞;白细胞介素类;干扰素ⅱ 型;免疫耐受
[ 中图分类号] r654.28 [ 文献标志码] a [ 文章编号] 1672-4488(2011)05-0399-04
the effects of th1/ th2 cytokines on npc-infusion-induced immune tolerance in heart-transplanted
rats li yu-qi ao , s u n li-j i a ng , z h a ng gu i-mi ng , y ao ru-y o ng (department of urology , t he affiliated hos- pital of qingdao university m edical collage , qingdao 266003 , chin a)
[ abstract] ob jective t o s tudy the relation ship betw een t h1/ th 2 cy tokine expression in serum and im mune tolerance , induced by non-parenchymal cells (n pc)of donated liver , of cardiac allografts in rats. methods a m odel of h eart t ransplant a- t ion w as created in 40 rats , and evenly randomiz ed to rejection group and immu ne-t olerance group .t he su rvival t ime of th e im plan- ted heart w as ob served , the exp ressions of serum th1/ th2 cy tokin es :in terferon-γ(ifn-γ), interleukin-2 (il-2), interleu kin-4 (i l-4), interleukin-6 (il-6)and interleu kin-10 (il-10), w ere measu red . results t he survival t ime of heart allografts in tole rance group was (30 .83 ±2 .55)d , and that in rejection g rou p w as (8 .15 ±2 .08)d , the di ff erence being significant betw een the tw o groups (t =24 .46 , p <0 .01).seven and 14 days after t ran splantation , the expression of th 1 cytokines (il-2 , ifn-γ)w ere m uch high er in rejection group th an in immu ne-t olerance g rou p , and that of t h2 cytokines (il-4 , il-10)w ere low er.seven day s after surgery , th e exp ression of il-6 in rejection group w as mu ch higher than imm une-t olerance g rou p (t =4 .50 -16 .20, p < 0 .01).conclus ion th e formation of immune tolerance is associated w ith interaction of t h1/ th 2 cy tokines.
[ key words] th 1 cells ;t h 2 cells ;heart t ransplan tation ;hepatocy te ;in terleu kins ;int erferon type ⅱ ;immu ne tolerance
随着医学诊疗技术的发展, qi官移植已成为终末期qi官衰竭病人的zui佳治疗方法, 而移植后免疫排斥反应阻碍了qi官移植广泛开展。诱导机体抗原特异性免疫耐受, 是解决qi官移植排斥的根本方法。已有研究认为, th1 与 th2 两类辅助性 t 细胞的相互作用与免疫耐受形成有关[ 1] 。本研究通过肝非实质细胞(n pc)诱导心脏移植免疫耐受的模型, 探讨 th1/ th2 细胞因子在诱导免疫耐受中的作用。
1 材料与方法
1 .1 材料
实验用 8 ～ 12 周龄、体质量为 200 ～ 250 g 的健
[ 收稿日期] 2011-01-16 ; [ 修订日期] 2011-03-21
[ 作者简介] 李玉侨(1985-), 男, 硕士研究生。
[ 通讯作者] 孙立江(1963-), 男, 博士, 主任医师, 硕士生导师。
康封闭群雄性sd 大鼠及 wistar 大鼠, 由青岛派特福德白鼠养殖专业合作社提供, lew is 大鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。collag enase ⅱ 、蛋白酶 e 、d nase ⅰ 、二甲基亚砜(d mso)购自 sigm a 公司, rpm i 1640 及淋巴细胞分离液购自solarbio 公司, 无支原体胎牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司提供, si裂霉素 c 由 ro che 公司提供。大鼠白细胞介素 2(il-2)、干扰素 γ(ifn- γ)、白细胞介素 4(il-4)、白细胞介 6(i l-6)、白细胞介素 10(il-10)试剂盒由上海恒远生物科技有限公司提供。
1 .2 模型的建立及分组
sd 大鼠为供体, wistar 大鼠为受体。颈部心脏移植模型建立具体方法参照文献[ 2] 并进行改进。将供者心脏的主动脉与受者的颈总动脉、供者心脏
400 青 岛 大 学 医 学 院 学 报 47 卷
的肺动脉与受者的颈外静脉行端端吻合。供心血液循环途径为:受体颈总动脉-供心主动脉-冠状动脉- 冠状静脉-右心房-右心室-肺动脉-受体颈外静脉 。手术成功标准:供心再灌注后颜色鲜红, 收缩有力, 吻合口无渗血, 存活 72 h 以上。
将 40 只大鼠随机分为排斥反应组(a 组)和免疫耐受组(b 组), 每组 20 只。术中及术后由于血栓形成 、窒息 、移植时间过长、移植心脏停搏等原因失败5 只, 其中a 组2 只, b 组 3 只。a 组经尾静脉注射生理盐水 1 m l , 7 d 后行 sd ※wistar 大鼠颈部心脏移植 ;b 组术前 7 d 经尾静脉注射 wistar 大鼠 npc 2 ×10 个(1 m l)。
1 .3 npc 悬液的制备
参照张燕华等[ 3] 所报道的方法。经门静脉插管用 d-h anks 液原位灌注后无菌取下肝脏, 剪碎, ⅱ 型胶原酶消化, 过 200 目钢si网制成细胞悬液, 再以蛋白酶e 、d nase ⅰ消化并离心, 用rpm i 1640 培养液清洗后获得的细胞即为npc 。锥虫蓝拒染法鉴定活细胞数>95 。
1 .4 检测指标和方法
1 .4 .1 移植心脏平均存活时间(ms t) 移植心触诊判断是否存活, 每日颈部心脏触诊, 记录移植物存活和排斥反应发生的时间。以供心增大、停止搏动作为排斥反应的终点。存活时间从移植当天统计至 失活前 1 d 。
1 .4 .2 混合淋巴细胞反应(m lr) 输注 npc 7 d
后两组各取大鼠 5 只, 分别测定其对供体大鼠及第三品系lew is 大鼠的m lr 。a 组及b 组大鼠淋巴细胞为反应细胞, 供体及 lew is 大鼠淋巴细胞为刺激细胞。
1 .4 .2 .1 供体淋巴细胞的制备 参照文献[ 4-5] ,
即从大鼠脾中分离出单个核细胞, si裂霉素c 处理后用含体积分数 0 .10 胎牛血清的 rpm i 1640 培养液调整细胞密度为 2 ×109 / l 。
1 .4 .2 .2 反应细胞的制备 从大鼠脾中分离出单个核细胞, 用含体积分数 0 .10 胎牛血清的 rpmi 1640 培养液调整细胞密度为 2 ×10 / l 。锥虫蓝染色鉴定细胞活率均>95 。
1 .4 .2 .3 混合淋巴细胞培养 参照文献[ 4-5] , 取
上述细胞各 50 μl 分别按如下分组加入 96 孔板, 置
37 ℃、体积分数 0 .05 co 2 培养箱中培养 5 d 。1组:sd 大鼠单个核细胞 50 μl +a 组大鼠单个核细胞 50 μl ;2 组 :sd 大鼠单个核细胞 50 μl +b 组大
鼠单个核细胞 50 μl ;3 、4 组以 lewis 大鼠单个核细胞作为刺激细胞, 每组设3 个复孔。终止培养前 4 h , 每孔加m tt 20 μl 。终止培养后, 吸弃培养液, 每孔加dmso 150 μl , 待结晶完全溶解后, 在酶标分析仪上测定 490 nm 处 a 值。以刺激指数(si)判断细胞活性高低 :si =实验孔 a 值/ 对照孔 a 值。
1 .4 .3 th1/ th2 细胞因子 心脏移植后 7 、14 d ,分别采集各组受体大鼠尾静脉血, 采用酶联免疫吸附试验检测血清il-2 、if n-γ、i l-4 、il-6 、i l-10 的水平。按试剂盒说明操作。
1.5 统计学处理
采用spss 17 .0 软件进行统计学处理, 实验数据以 x ±s 表示, 组间比较采用 t 检验。
2结 果
2 .1 m st
a 组ms t 为(8 .15 ±2 .08)d , b 组为(30 .83 ±
2 .55)d , 两组比较差异有显著意义(t =24 .46 , p <
0 .01)。
2 .2 受者大鼠血清中 th1/ th2 细胞因子的表达
术后 7 、14 d , b 组血清中t h1 细胞因子i l-2 和ifn-γ表达水平较 a 组明显下降, th2 细胞因子il-4 、il-10 表达水平较a 组明显上升, 术后 7 d 血清il-6 表达水平较a 组明显下降, 差异均有统计学意义(t =4 .50 ～ 16 .20 , p <0 .01)。见表 1 。
2.3 m lr
在npc 输注 7 d 后, b 组si 值(3 .97 ±0 .33)较 a 组(7 .09 ±0 .25)显著降低(t =17 .00 , p <0 .01);
第三品系lew is 大鼠脾细胞作为刺激细胞时, b 组si 值(7 .36 ±0 .31)与 a 组(7 .51 ±0 .70)比较差异无显著性(t =0 .45 , p >0 .05)。
3讨 论
供者特异性抗原能诱导受体产生免疫耐受并促进移植物存活已有较多报道[ 6-9] 。本实验在未应用免疫抑制剂的情况下, 术前 7 d 给予受体大鼠尾静脉输注供体npc 后, 行颈部心脏移植, 结果显示, 免疫耐受组供心存活时间较免疫排斥组明显延长, 说明npc 成功诱导了免疫耐受, m lr 证实这种免疫耐受为供体特异性的。那么 npc 是如何诱导免疫耐受的?
sta rzel 等[ 10] 提出的“ 微嵌合体学说”和“ 双
向移植排斥”理论, 可能是移植免疫耐受诱导和维持
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